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Généralités sur les techniques chromatographiques sur colonne
La chromatographie est une technique de séparation. L'échantillon à analyser est introduit dans la phase mobile qui traverse la phase stationnaire, immobile ou fixe. Ce mouvement entraîne l'échantillon. Les différents constituants, n'ayant pas les mêmes interactions avec chacune des phases, sont ainsi séparés par différence de vitesse de migration le long du système chromatographique. L'appareil qui permet de faire de la chromatographie est le chromatographe. Il remplit 3 grandes fonctions :
Différentes classificationsOn peut classer les différentes chromatographies par le type de phase stationnaire utilisée pour la séparation:
ou suivant l'état de la phase mobile
ou suivant le type d'appareillage utilisé
Notions de basesVoici les définitions de notions fondamentales en chromatographie valables aussi bien en chromatographie en phase gazeuse qu’en phase liquide.
Temps mis par les molécules d'un composé à analyser (soluté) pour parcourir le trajet entre l'entrée et la sortie de la colonne. C'est le temps total passé dans la colonne. Le temps de rétention peut être aussi mesuré entre l’entrée et la sortie du système chromatographique. Le temps de sortie, ou temps de rétention, est caractéristique du constituant, pour des conditions d'analyse données. La surface d'un pic est fonction de la quantité de constituant dont il est la trace. Temps mis par les molécules d'un composé à analyser (soluté) pour parcourir le trajet entre l'entrée et la sortie de la colonne représentant le temps passé dans la phase stationnaire. tr = t'r + tm Équation 1 En chromatographie, chaque composé présentant une certaine affinité pour la phase stationnaire, passera tour à tour de la phase mobile à la phase stationnaire et inversement. Leur affinité est traduite par un coefficient dit de partage Le temps de rétention tr d'un soluté est fonction de son affinité avec la phase mobile d'une part, et avec la phase stationnaire, d'autre part. A un instant t, le soluté est à la concentration Cm dans la phase mobile et à la concentration Cs dans la phase stationnaire. Le rapport à l'équilibre est appelé coefficient de partage K.
Équation 2 Lorsque le soluté n'a aucune affinité avec la phase stationnaire, Cs est nulle, donc K = 0. Le soluté n'est pas retenu dans la colonne. En chromatographie liquide, le coefficient de partage est fonction de trois types d'affinités:
Soluté
Phase stationnaire En chromatographie en phase gazeuse, le coefficient de partage est fonction des interactions entre le soluté et la phase stationnaire, Soluté Facteur de Capacité k'
Équation 3 C'est le rapport de la quantité d'un même soluté, dans la phase stationnaire et dans la phase mobile. Vs : volume de phase stationnaire Cs : concentration du soluté dans la phase stationnaire Vm : volume de phase mobile ou volume mort Cm : concentration du soluté dans la phase mobile k' est aussi le rapport du temps passé par une espèce dans la phase stationnaire sur le temps passé par cette même espèce dans la phase mobile. k' peut être déterminé expérimentalement par l'équation suivante :
Équation 4 Notion d'efficacitéLa largeur d'un pic est caractéristique de l'efficacité de la séparation. L'efficacité est mesurée par le nombre de plateaux théoriques Nth (par analogie avec la distillation) :
En Génie chimique, dans une colonne à distiller, on définit un plateau théorique comme étant une portion de colonne d'où les 2 phases sortent en équilibre thermodynamique entre elles. Le nombre de plateaux théoriques Nth représente l'efficacité de la colonne pour chaque composé.
Équation 5 avec Nth : nombre de plateaux théoriques tr : temps de rétention W½ : largeur du pic à mi hauteur Il est plus judicieux d'utiliser le nombre de plateaux effectifs puisqu’il dépend vraiment du temps passé dans la phase stationnaire :
Equation 6 avec Neff : nombre de plateaux effectifs tr : temps de rétention tm : temps mort W½ : largeur du pic à mi - hauteur Neff et Nth sont sans dimension Connaissant la longueur L de la colonne et le nombre de plateaux théoriques Nth on définit une Hauteur Equivalente à un Plateau Théorique (HEPT). HEPT = L / Nth Équation 7 La HEPT est fonction de différents paramètres qui eux-mêmes sont susceptibles de varier avec la vitesse de la phase mobile. Ceci est décrit par l'Équation 8. En conséquence, l'efficacité calculée par les équations précédentes est fonction de la vitesse de la phase mobile donc du débit. Une bonne colonne est capable de séparer des produits qui ont des temps de rétention proches. Pour cela, le pic de chaque soluté doit être le plus fin possible. Trois facteurs sont la cause de l'élargissement des pics : la diffusion turbulente, la résistance au transfert de masse et la diffusion longitudinale. Leur contribution (H) est symbolisée par la relation suivante qui relie la hauteur équivalente à un plateau théorique (HEPT) et la vitesse de la phase mobile (u). HEPT = f(u) = Hturbulente + Htransfert de masse + Hlongitudinale Équation 8 : hauteur équivalente à un plateau théorique Cette équation est la somme des facteurs suivants (Équation 9 à Équation 11). L'élargissement dû à la diffusion turbulente est expliqué par le fait qu’il existe différents chemins parcourus par des molécules d'une même sorte de soluté. La longueur des chemins n'étant pas la même, elles ne mettent pas toutes le même temps pour traverser la colonne ; le pic s'élargit. Ce phénomène est appelé anisotropie d'écoulement et est symbolisé par la lettre A. Hturbulente = A Équation 9 : H turbulente A est fonction de la nature des particules et de la régularité du remplissage de la colonne. L'élargissement s'explique aussi par l'accumulation de la phase mobile dans les anfractuosités du support : les molécules qui diffusent dans les poches de phase mobile vont moins vite que celles qui n'y diffusent pas. L'accumulation de la phase mobile est plus importante en milieu liquide qu'en milieu gazeux. La résistance au transfert de masse y est plus importante. Le soluté peut aussi diffuser à l'intérieur de la phase stationnaire, ce qui réduit encore la vitesse d'échange et nuit à l'efficacité. Plus la vitesse de la phase mobile augmente, plus le phénomène de résistance au transfert de masse nuit à l'efficacité. Htransfert de masse = C.u Équation 10 : H transfert de masse C est une constante, u représente la vitesse de la phase mobile. Le coefficient de diffusion molaire est beaucoup plus faible en milieu liquide qu'en milieu gazeux. Cette diffusion malgré tout existe. Elle peut être comparée au mouvement brownien. Elle permet d'expliquer une partie de l'élargissement des pics. Hlongitudinale= B/u Équation 11 : H longitudinale Dans la pratique la diffusion longitudinale est négligeable à des vitesses ordinaires de phase mobile en milieu liquide. Qualité de la séparation
On définit la sélectivité comme étant le rapport des temps de rétentions réduits:
Équation 12 a est toujours > 1 car t'rb est > t'ra Si dans certaines conditions, deux constituants sortent à des temps proches, leurs pics risquent de se chevaucher. En optimisant les conditions analytiques, il est possible d'améliorer l'allure du chromatogramme. Le paramètre de résolution R quantifie la qualité de cette séparation. Bien qu’on la mesure, en général sur 2 pics contigus, elle peut être calculée sur n’importe quel couple de pics. Pour cela on trace les tangentes aux points d’inflexion et la distance entre les intersections avec la ligne de base correspond à la largeur du pic utilisée pour le calcul.
Figure 2: Deux pics de chromatogramme et tracé des tangentes pour le calcul de la résolution .
Équation 13 trA et trB : temps de rétention des 2 pics contigus. W0 A et W0 B : largeur de ces pics à leur base. W1/2A et W1/2B : largeur de ces pics à mi-hauteur. si R < 1 mauvaise résolution si 1 < R < 1,5 acceptable si 1,4 < R < 1,6 optimale si R > 1,6 trop bonne résolution (car le temps d'analyse est rallongé). Il est parfois utile d’exprimer la résolution en fonction de la sélectivité et de l’efficacité du dernier des 2 pics intéressants.
Équation 14
Création : 16 juin 1999, dernière mise à jour : 2001. |
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ATTENTION, ce cours n'évolue plus depuis 2001, pages "perso" de Vincent.Dalmeyda(chez)free.fr |
Phase mobile
ou 
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